|
Рефераты Главная Финансовое право Финансовый менеджмент финансовая математика Финансы деньги кредит Французский Компьютерные сети Конституционное право зарубежныйх стран Конституционное право России Краткое содержание произведений Программирование компьютеры и кибернетика Производство и технологии Психология Разное Религия и мифология Трудовое право Туризм Уголовное право и процесс Управление |
Криоконсервации спермы русского осетра и севрюгиСперму от самцов русского осетра и севрюги отбирали методом сцеживания. Ее до замораживания хранили в холодильнике при t = +4°С. Время хранения от 1.5 часов до 2 суток.Перед замораживанием сперму первоначально смешивали с одним из образцов криопротектора, затем смесь оставляли на эквилибрацию (до 40 минут) при комнатной температуре. После этого образцы раскапывали в пробирки Эпендорфа и начинали замораживание в парах жидкого азота. Для этого замаркированные пробирки помещали на площадку, которая находилась в емкости с жидким азотом и «плавала» на его поверхности (рис. 1). Температура на поверхности пластины - -70 - -100°С. Время выдерживания образца в парах жидкого азота устанавливали экспериментально, после чего последний погружали в жидкий азот (t = -196°С). Вместе с тем апробировали способ сверхбыстрой заморозки спермы на тефлоновом планшете (рис. 3), которую помещали на поверхность жидкого азота в кювету. Сперму автоматическими пипетками раскапывали по гнездам пластины. Замороженные шарики ссыпали в емкость, объемом до 20 мл., которую помещали в жидкий азот.Для проведения исследований влияния скоростей замораживания на качество и жизнестойкость образцов было необходимо осуществить калибровку температур в опытной камере. Рофиль распределения температур в зависимости от расстояния до поверхности жидкого азота приведен на рис. 2.49 12432Рис. 1 Установка для замораживания образцов.1 - емкость. 2 - жидкий азот. 3 - пенопластовая пластина на поверхности жидкого азота. 4 - замораживаемый образец.Рис. 2. Профиль температуры в экспериментальной установке.Размораживание образца осуществляли следующим образом. Быстрый вариант. Образец помещали под водяную баню, где температуру среды поддерживали 36-38°С. После оттаивания (время от 2 до 4 минут) замороженный образец помещали в базовый раствор для отмывки от криопротектора. Время отмывки для каждого вида осетровых рыб устанавливали отдельно.Рис. 3. Планшет для быстрой заморозки образцов.Рис. 4. Установка для замораживания спермы осетровых рыб.За выходные показатели в экспериментах принимали время жизни сперматозоидов после оттаивания и отмывки протектора до полной их остановки, а также % подвижных спермиев в зоне видимости микроскопа. Третьим показателем являлся процент оплодотворения икры дефростированной спермой.Статистическую обработку результатов осуществляли с применением приемов Теории планирования экспериментов. Использован план однофакторного блочного эксперимента с дисперсионным анализом. За факторы принимали образца криопротекторов, за блоки - сперму от разных самцов. Значимость различий между факторами и блоками устанавливали с применением F-критерия Фишера.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕПеред началом эксперимента было необходимо проверить ряд параметров факторов. К таковым в первую очередь относятся: возможность криоконсервации спермы осетровых рыб любого качества и установление концентраций компонентов криопротекторов.3.1. Оценка качества нативной спермыРусский осетр. Нативную сперму русского осетра получили от 9 самцов путем сцеживания. Результаты оценки качества представлены в табл. 1Таблица 1.Оценка качества нативной спермы русского осетра.
Примечание: N = 9. М = 4.9, . m = ±0.42.После статистической обработки вариационного ряда оказалось, что по своим показателям сперма от разных самцов русского осетра достоверно не отличается друг от друга, Ошибка измерения составила m = ±0.42, что свидетельствует о незначительном разбросе показателей. Последнее свидетельствует, что можно замораживать сперму всех самцов. В среднем количество подвижных спермиев составило 100% во всех пробах, среднее время их жизни - 4.9 минуты, что соответствует рыбоводным нормативам (3 минуты). Для глубокой заморозки отобраны пробы самцов №№ 1- 6.Севрюга. Получена сперма от 6-ти самцов. Седьмая проба состояла из смеси спермы от разных производителей. Результаты оценки качества приведены в таблице 2.После статистической обработки вариационных рядов оказалось, что сперма севрюги от разных самцов достоверно отличается друг от друга. Поэтому криоконсервации отобраны образца спермы от самцов №№ 1, 3, 4, 6.Таблица 2.Оценка качества нативной спермы севрюги.
Примечание: N = 7. % подвижности: М = 45.7, m = ±2.59,время жизни: М = 5.11, m = ±0.86.Впоследствии была получена сперма от самцов севрюги №№ с 9 по 19. Их оценка качества представлена в таблице 3.Таблица 3.Оценка качества нативной спермы севрюги.
Примечание: N = 7. % подвижности М = 64.3, m = ±1.9время жизни М = 1.6, m = ±0.4.После статистической обработки данных и их анализа установлено, что этот материал не пригоден для глубокой заморозки в жидком азоте, так как в основной массе по всем показателям данный материал не отвечает рыбоводным показателям. Если же принять во внимание ожидаемое ухудшение качества спермы по принятым показателям (% подвижных сперматозоидов и время жизни спермиев), то после температурного шока (криоконсервации) такая сперма вряд ли может демонстрировать положительные свойства при оплодотворении. Поэтому принято решение данный биологический материал исключить из эксперимента.3.2. Подбор оптимальных концентраций составляющих протекторовРусский осетр. В качестве основных составляющих криопротекторы веществ являлись: глицерин, ДМСО, гепарин, сахароза, яичный желток и манит. За основной показатель для оценки концентрации апробируемых веществ принимали временя жизни сперматозоидов. Результаты тестирования приведены в табл. 4. Таблица 4. Результаты установления концентраций.
Для русского осетра были отобраны ряд вариантов криопротекторов, отличающихся друг от друга составом криопротектора №№ 1. 2. 3 и 4 и режимом заморозки-разморозки. Их различия были зашифрованы под следующими обозначениями: ОТ, БОТ, АБ и АС. Для реализации эксперимента был использован однофакторный блочный тип планирования эксперимента (Адлер, 1969), где за блоки принимали сперму от разных самцов, а за факторы - варианты криопротекторов и режимы криоконсервации. За выходные показатели выбрали как время жизни сперматозоидов, так и % живых спермиев в опыте и контроле. Результаты эксперимента приведены в таблицах 5 - 8. Таблица 5.Однофакторный блочный эксперимент (% живых сперимев)
Статистическая обработка результатовКорректирующий член ТШІ/N = 1028/54 = 19570, где N= 54.SSобщ. = ??yiІ - TЦІ/N = 69250 - 19570 = 49680.SSфак. = ?TiІ/n - К.Ч. = 43322 - 19570 = 23742, где n = 9.SSбл. = ?TiІ/k - К.Ч. = 9859.Ssош. = 49680 - (23742 + 9859) = 16079Таблица 6.Дисперсионный анализ
F кр. Факторы = 2967 / 7750 = 11.8.Fкр.бл. = 1971 / 7750 = 7.8Таблица 7.Однофакторный блочный эксперимент (время жизни спермы)
N = 54. n = 9. k = 6Статистическая обработка результатовК.Ч. TШІ/N = 800.4SSобщ. = 2989.5 - 800.4 = 2189.1SSфакт = 5630.3 : 9 - 800.4 = 625.6 - 800.4 = - 174.8SSбл. = 1229.4 - 800.4 = 429.SSош. = 2189.1 - (-174.8 + 429) = 1934.9Таблица 8.Дисперсионный анализ
F кр. факторы. = 0.7; Fкр. блоки = 2.8.Из результатов дисперсионного анализа по времени жизни спермиев после дефростации видно, что между протекторами нет значимых различий при значимости последних между блоками, т.е. все протекторы «работают» одинаково. По полученным коэффициентам регрессии Ti по обоим видам оценки качества биологических проб были составлены ранжированные ряды (рис. 5, 6). Рис. 5. Ранжированный ряд криопротекторов и режимов замораживания-оттаивания образцов (% живых спермиев). Анализ ранжированных рядов свидетельствует о том, что состав криопротекторов имеет более существенное значение для сохранения жизнеспособности клеток при глубоком замораживании чем режимы заморозки-оттаивания. Процент подвижных спермиев как показатель качества оказался менее объективным, чем время жизни клеток этого типа, так как в сравнительно короткие сроки достоверно установить величину этого показателя довольно сложно. Для получения надежных данных необходим достаточный опыт работы. Поэтому в дальнейших исследованиях принимается решение использовать его лишь как косвенные данные, пригодные для дальнейших расчетов количества дефростированной спермы при оплодотворении получаемых объемов икры. Рис. 6. Ранжированный ряд криопротекторов и режимов замораживания-оттаивания образцов (время жизни спермиев). Состав криопротектора № 3 по времени жизни сперматозоидов русского осетра оказался выше остальных, исследуемых в данном эксперименте. Севрюга. В качестве контроля использовали нативную сперму (табл. 2; средне время жизни 5.11 мин., % подвижных сперимев - 45,7%). В качестве факторов использовали составы протекторов №№ 1-4. Протектор № 5 представлял собой раствор глицерина в концентрации, принятой для холоднокровных животных. Эксперимент по установлению оптимальных составов криопротекторов спланирован по типу однофакторного блочного. За факторы принимали различные составы криопротекторов, за блоки - сперму от отдельных самцов. Эксперимент реализовали в двух повторностях, что позволило существенно снизить общую ошибку. За выходные показатели взяты время жизни спермиев и процент подвижности сперматозоидов в пробе. Результаты обработаны как отдельные выборки. Последние представлены в таблицах 9 - 12. Таблица 9. Влияние состава криопротекторов на время жизни спермы севрюги.
Статистическая обработка результатов 1. Корректирующий член (КЧ) TШІ/N = 721.7, где N = 40. 2. SSобщ. = 292.9. 3. SSфак. -= 585.2. 4. SSбл. = 1089.4, 5. SSош. = -1381.7 Таблица 10. Дисперсионный анализ
Таблица 11. Влияние состава криопротекторов на процент подвижности сперматозоидов севрюги.
Статистическая обработка. 1 Корректирующий член (КЧ) = 1690, 2. SSобщ. = 925. 3. SSфак. = 1510, 4. SSбл. = 2660, 5. SSош. = 3245. Из результатов дисперсионного анализа видно, что между факторами и между блоками в обоих случаях существуют статистически значимые различия. Последнее означает, что сперма от отдельных самцов севрюги существенно отличается друг от друга. Так сперма самцов 1 и 2 являются наилучшими по времени жизни (коэффициенты регрессии 80 и 70 соответст-венно). Худшей оказалась сперма самца № 3 (коэфф. регр. 50). Между криопротекторами различия статистически значимы (Fкр. = 4.9 и 5.4, Fтабл. = 2.26). Исходя из этого возможно построить ранжированные ряды «работы» криопротекторов, где «качество» их действия по обоим показате-лям располагали в порядке убывания Уср. (табл. 9 и 11). Ранжированные ряды представлены на рис. 7 и 8. Таблица 12. Дисперсионный анализ.
Рис. 7. Ранжированный ряд действия криопротекторов на время жизни сперматозоидов севрюги. Рис. 8. Ранжированный ряд действия криопротекторов на процент подвижных сперматозоидов севрюги. Из рис. 8 видно, что процент подвижности дефростированной спермы существенно уступает нативной. Вместе с тем, данный показатель, как и в эксперименте с русском осетром является субъективной оценкой, так как в поле зрения микроскопа попадает в этом состоянии далеко не все подвижные спермии. В то же время было установлено, что при замораживании и дефростации у некоторых спермиев обламываются хвосты, однако сама клетка остается целой и способной к оплодотворению. Если в естественных условиях данная аномалия играет отрицательную роль при оплодотворении, то при искусственном перемешивании дефростированной спермы с икрой в ограниченном пространстве (таз) этот показатель не может играть определяяющей роли при оценки качества спермы. Таким образом единственной экспресс оценкой размороженной спермы может служить время жизни спермиев после оттаивания. Последнее также является критерием при отборе проб в производство. Из рис. 7 видно, что использование криопротектора № 2 увеличивает время жизни спермиев по сравнению с контролем. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что при двойном термическом ударе (заморозка-оттаивание) наиболее слабые спермии погибают и остаются более сильные клетки, способные к оплодотворению. Составы криопротекторов №№ 4, 3 и 1 оказались хуже контроля, следовательно их использование для рыбоводного процесса с севрюгой целесообразно исключить, а глицерин (крипротектор № 5) вообще не пригоден для использования при криоконсервации спермы осетровых рыб. Различия в составах криопротекторов для русского осетра и севрюги свидетельствует об видовой специфичности спермы данных видов рыб. Исходя из этого является необходимым для каждого вида осетровых рыб подбирать определенные составы криопротекторов, где основными компонентами остаются базовый раствор, сахароза, яичный желток, манит и ДМСО. Гепарин рекомендуется использовать при дефростации замороженных образцов с целью предотвращения слипания клеток. ЗаключениеНа основании проведенных экспериментов возможно сделать следующие выводы:1. Самцы русского осетра и севрюги по качеству половых продуктов достоверно различаются друг от друга. Поэтому при криоконсервации необходимо отбирать сперму только высокого качества, отвечающую стандартным рыбоводным показателям.2. Из двух показателей качества спермы на промежуточных этапах криоконсервации наиболее адекватным является время жизни спермиев (до остановки последнего сперматозоида в поле видимости микроскопка). Процент подвижных спермиев может служить лишь косвенной оценкой так как здесь присутствует фактор субъективности исследователя. Слишком высока ошибка за счет исследователя.3. Основными компонентами криопротекторов для осетровых рыб являются: ДМСО и манит. Базовый раствор необходим для поддержания РН среды при введении разных составляющих. Сахарозы и яичный желток необходимы как энергетический запас для клеток после двойного термического шока (заморозка - разморозка).4. Рецептуры разный криопротекторов отличаются соотношением основных компонентов.5. Составы криопротекторов для русского осетра и севрюги оказались разными. Это свидетельствует о том, что последние являются видоспецифичными для спермы разных видов осетровых рыб. Исходя из этого, при криоконсервации спермы новых видов осетровых необходимо подбирать новый состав криопротектора.Список использованной литературы1. Абдуллаев М.А., Бакаев С.Б., Пославский А.Н. Экологические проблемы охраны живой природы. //М., 1990, т 1, с.75.2. Андреев А.А., Петропавлов Н.Н. Генетические криобанки в проблеме сохранения биоразнообразия. //В. сб научных трудов «Консервация генетических ресурсов» Пущино. 1994, -С 35-81с.3. Ананьев В.И., Гахова Э.Н., Катосонов В.Я., Ротт Н.Н., Цветкова Л.И. Концепция сохранения и устойчивого использования биоразнобразия с применением методов криоконсервации геномов гидробионтов. // М, 1997, с 1-36.4. Ананьев В.И. Новые технологии криоконсервации биологических объектов для управления биоразнообразием в аквакультуре и природных популяциях. //Рыбное хоз-во. Сер. Аквакультура: Информационный пакет. ВНИЭРХ, 1997, вып. 1, с. 36-47.5. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. //М. «Наука» 1989, -125 с.6. Баранникова И.А., Никоноров С., Белоусов Л.Н. Проблема сохранения осетровых России современный период. /Международная конферен-ция «Осетровые рубеже 21 века». Астрахань. 11 -15 сент. 2000, Тезисы докладов. //Астрахань. 2000. - С. 7-8.7. Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. //М. «Высшая школа» 1987, 80с.8. Брегман Ю.Э., Найденко Т.Х. Криоконсервация геномов гидробионтов. //Бюлл. Дальневосточного отдел. РАН. 1992, № 1-2. -С76-78.9. Будыко М.И. Глобальная экология. // М., «Мысль» 1977, 126 с.10. Букварева Е. Н. Сохранение генофонда животного мира и проблема минимальной численности популяции. //Консервация генетических ресурсов. Пущино, ОНТИ ПИЦ РАН. 1985г, 27с.11. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Экспериментальные и теоретические предпосылки получения живых животных из клеток, несущих генетическую информацию. В серии: Консервация генетических ресурсов. //Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН. 1980, 71с.12. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Консервация генетических ресурсов. Информационный материал. //Пущино, 1981, - 24с.13. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н Проблема сохранения генофонда. /М. «Знание». 1985, -С 1-59.14. Вепринцев Б.Н,. Ротт Н.Н. Стратегия сохранения животного и растительного мира Земли. Консервация генетических ресурсов. //Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН. 1991г. -с 5-35.15. Вуд М., Уиттингхем Д., Ролл. Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мыши. Биология развития млекопитающих. Методы. М., Мир. 323-356с. 1990г.16. Гахова Э.Н. Митохондрии спермиев лягушки при замораживании. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 47 - 55.17. Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А. Некоторые аспекты криоконсервации эмбрионов и спермы. // Проблемы криобиологии, № 2. 29-36с. 1994г.18. Дьяконов Л.П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии. //Труды ВИЭВ. т.71. 1998.19. Карамарова Л.И., Гахова Э.Н., Карнаухов В.Н. Гипометаболические факторы зимоспящих как возможные регуляторы резистентности клеток к низким температурам. / В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 47- 55.20. Карнаухов А.В. О роли биоразнообразия в сохранении климата Земли. // В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1981, -С 34-54.21. Карнаухов В.Н., Карнаухов А.В. Возможность экологической катиастрофы и снижения биоразнообразия в пресных водах Северной Америки. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 17 - 20.22. Карнаухов В.Н. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. //М «Наука» 2001, -186 с.23. Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В., Мороз Л.Г., Наук В.А. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. //Л.: Агропром-издат. Ленинградское отделение. 1998, 186 с.24. Лозино-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Адаптации и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам. //Л: Наука. 1972, 288с.25. Малютин B.C. Проект федеральной программы по сохранению и устойчивому использованию осетровых рыб, включая комплекс мер по развитию искусственного воспроизводства и товарного осетроводства. Международная конференция "Осетровые на рубеже 21 века", Астрахань, 11--15 сент., 2000: Тезисы докладов. //Астрахань, 2000. -- С. 12--14.26. Межевикина Л.М., Каранова М.В. Использование антифризных гликопротеинов при замораживании в жидком азоте ранних зародышей мыши. //Известия. Акад. наук. Сер. биол. 1995. -С 113 - 145.27. Мельников В.Н., Прямухина Н.В. О мерах по сохранению и восстановлению запасов осетровых в Каспийском бассейне. Международная конференция "Осетровые на рубеже 21 века", Астрахань, 11--15 сент., 2000. Тезисы докладов. //Астрахань. 2000. -- С. 77--78.28. Наук В.А., Борончук Г.В., Ротт Н.Н. Длительное сохранение спермы сельскохозяйственных и диких животных. //В. сб научных трудов «Консервация генетических ресурсов» Пущино. 1991, -С35-81.29. Никитин В.А. Технология генетически идентичных близнецов. Возможности и перспективы. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994, т. 6, -С 56 - 61.30. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей.//Киев: Урожай.. 1978, 255с.31. Павлов Д.С. Подходы к охране редких и исчезающих рыб. Информационный материал. //Научный центр РАН, Пущино, 1993, 126 с.32. Розанов Р.М., Каримов Б.К. Экологические проблемы охраны живой природы, //М. «Высшая школа», 1990, т.1, с. 70.33. Розанов С.И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия. /В сб. «Биофизика живой клетки. //Пущино, 1994,т.6, -С 8-13.34. Ротт Н.Н. Создание генетических криобанков и использование методов биологии развития как способ сохранения редких видов. //М, Журнал ВНД, 1996, Т. 27. № 4, -С 45-48.35. Ротт Н.Н. Создание генетических криобанков и использование методов биологии развития как способ сохранения редких видов животных. Криоконсервация спермы диких млекопитающих. // Онтогенез. 1995 т 26. №4. 270-281с.36. Савушкина С.И. Влияние криоконсервации на подвижность сперматозоидов русского осетра (Acipensеr gueldenstadti br.) //2-й Междуна-родный симпозиум "Ресурсосберегательные технологии в аквакультуре", Адлер, 4--7 окт., 1999. //Матер. докладов. Краснодар, 1999. - С. 90.37. Сулей М., Уилкокс Б. Биология охраны природы. //М., Мир, 1983, 430с.38. Сулей М. Жизнеспособность популяций. //М., Мир 1989, 224 с.39. Тихомиров А. М. Витвицкая Л. В. Курс лекций по дисциплине «осетроводство» часть 3. //Астрахань, АГТУ, 2001, 125 с.40. Шпаро М.И. Криопротекторы. Криоконсервация клеточных суспензий. //Киев, «Наукова Думка, 1983. 289 с.41. Яблоков А.В., Остроумов С.А. Охрана живой природы: проблемы и перспективы. //М., Лесн. пром., 1983г. 269с.42. Fahy G.M. The relevance of cryopotectant “toxicity” to cryobiology. //”Cryobiology”, 1986, 23. -p. 1-13.43. Grunina F.S., Neifakh F.F. Induced diploid androgenesis. //Phisiol/ end Gen. Biologi rev., 1997 v/ 13, part 1, -p. 73-103.44. Somme L. Supercooling and winter survival in terresthal arthopods. //Comp. Biochem. Phisiol. 1982, 73A, -р. 519 - 543.Страницы: 1, 2 |
|